Вирусные болезни рептилий, вызываемые РНК-содержащими вирусами
Сокращения: ВЗН — вирус Западного Нила, ЖКТ — желудочно-кишечный тракт, ИФАт —
иммунофлуоресцентные антитела, НЭМ — негативная электронная микроскопия, ПЦР —
полимеразная цепная реакция, РИФ — реакция иммунофлуоресценции, РН — реакция
нейтрализации, РТГА — реакция торможения гемагглютинации, ТЭМ — трансмиссивная
электронная микроскопия, ЦНС — центральная нервная система, ЦПД — цитопатогенное
действие, ЭПР — эндоплазматический ретикулум, ELISA — твердофазный
иммуноферментный анализ, IBD— Inclusion Body Disease (болезнь телец включения),
nested PCR — гнездовая ПЦР; RT-PCR — ПЦР в режиме реального времени
Сообщения об обнаружении вирусов в тканях больных и клинически здоровых рептилий
начали появляться с конца 60-х гг. XX века. За более чем 40 лет вирусы были
найдены у представителей всех отрядов рептилий, включая гаттерий. К настоящему
моменту от рептилий выделены представители не менее 7 семейств РНК-содержащих и
не менее 6 семейств ДНК-содержащих вирусов. Рептилиям были экспериментально
инокулированы возбудители, по крайней мере, 12 вирусных болезней человека и
животных. При этом отмечали широкий спектр реакций — от низкотитровых до
нормальной репликации вируса в тканях инфицированных животных. Тем не менее
полноценных нозологических единиц, т.е. четко охарактеризованных (в соответствии
с постулатами Коха) болезней вирусной этиологии, не так уж много. Далеко не все
из них имеют серьезное значение в ветеринарии рептилий. Однако открытие в
последние годы нескольких новых эмерджентных инфекций, несущих серьезную
потенциальную угрозу не только искусственно созданным, но и природным популяциям
рептилий и амфибий, заставляет гораздо внимательнее отнестись к вирусам как к
вероятным этиологическим агентам. К таким «новым» инфекциям можно отнести
ранавироз и хитридиомикоз амфибий, распространение ВЗН в популяции миссипских
аллигаторов в США и некоторых других видов крокодилов в иных регионах земного
шара, заболевание содержащихся в неволе ящериц типичным иридовирусом насекомых,
спонтанное заражение сухопутных и водных черепах ранавирусом лягушек,
распространение герпесвируса черепах за пределы естественного энзоотического
ареала, обнаружение се-ропозитивных к герпес вирусу и микоплазме черепах в
естественных популяциях, а в последнее время и манифестных больных, обнаружение
летального внутриядерного кокцидиоза у черепах в неволе и хламидийных инфекций у
европейских видов гадюк и др.
Эти вопросы приобретают все большее значение не только при содержании рептилий в
зоопарках или при использовании их как объектов зоокультуры, но особенно при
реализации программ по сохранению и реинтродукции редких видов, а также при
регуляции торговли, при транспортировке и установлении ветеринарных норм для
этой категории животных. В этом смысле ветеринарное законодательство пока
остается несовершенным. Так, в нашей стране при ввозе рептилий, проходящих по
категории «прочие животные», предусмотрены только копроскопия и
бактериологическое исследование на наличие сальмонелл. При этом такие серьезные
заболевания, как криптоспоридиоз, гексамитиаз, амебиаз, диссеминиро-ванные
микозы и подавляющее большинство вирусных инфекций остаются за рамками
стандартного диагностического протокола. Предусмотренный для этих животных
30-дневный карантин, как правило, недостаточен для выявления таких болезней, как
болезнь телец включения, парамиксовироз змей, герпесвироз черепах,
криптоспоридиоз и некоторых других. Без использования иммунологических и
молекулярных методов диагностики выявить персистентные инфекции у рептилий
вообще очень трудно. Значительный прогресс в разработке таких методов был
достигнут за рубежом за пос-ледние 5 лет. Это позволило выявить ряд новых
вирусных нозологии и в некоторых случаях проанализировать эпизоо-тическую
ситуацию и эволюцию вирусных патогенов. Тем не менее в настоящий момент новые
диагностикумы не имеют широкого практического применения и остаются в арсенале
лишь нескольких исследовательских лабораторий США и Европы. Вероятно, в
ближайшем будущем численность ветеринарных лабораторий, имеющих возможность
проводить вирусологическую диагностику болезней рептилий, существенно возрастет.
В этом случае в ряде стран такие исследо-вания будут введены в стандартный
протокол при получении ветеринарных сертификатов. Тогда список инфекций
репти-лий, контроль которых в случае перемещения животных обязателен, заметно
расширится, а для стран, не имеющих соот-ветствующих возможностей,
ужесточившиеся нормы транспортировки окажутся неприемлемыми. Все это может
нанести существенный удар по зооторговому рынку, в т.ч. и по вполне легальному.
В связи с этим основная цель данного сообщения — осветить современное состояние
вопроса, охарактеризовать возбудителей наиболее проблемных вирусных болезней
рептилий, обсудить принятые на сегодняшний день методы диагностики и терапии.
Ретровирусы
Общая характеристика. Семейство Retroviridae — большая группа вирусов,
поражающих все классы позвоночных и некоторых беспозвоночных (дрозофил,
ленточных гельминтов). Сферической формы вирионы диаметром 80...100нм состоят из
сердцевины, внутренней белковой мембраны и наружной липосодержащей оболочки, на
поверхности которой располагаются выступы длиной до 8 нм. В сердцевине различают
икосаэдрическую капсулу и нуклеоид. У ретровирусов типа С нуклеоид находится в
центре вириона. Геном ретро-вирусов, в отличие от такового всех других известных
виру-сов, — диплоидный, представлен двумя идентичными молекулами плюс-РНК,
кодирующими у большинства вирусов 4 основных гена. Характерная особенность этих
вирусов — наличие в составе вирионов РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной
транскриптазы).
По современным представлениям, в семействе Retroviridae выделяют 7 родов, при
этом ретровирусы С-типа рептилий пока не имеют собственного родового ранга, хотя
и отличаются от вирусов С-типа млекопитающих и птиц.
За исклю-чением IBD, почти все ретровирусные изоляты у рептилий были выделены из
опухолей . Ретровирусные частицы С-типа были обнаружены в эмбриональной
рабдомиосарко-ме у маисового полоза Elaphe guttata , в культивированных
клетках селезенки гадюки Рассела с миксофибромой , у обыкновенного удава с эритролейкозом и у нескольких пятнистых жарарак Bothrops moojeni с
опухолями почек. Несколько не связанных с опухолями ретровирусов было
обнаружено в клеточных линиях сердца гадюки Рассела , в ядовитой железе жараракуссу и в тканях гат-терии Sphenodon punctatus
. Ретровирусы, включая
эндогенные провирусы, постоянно обнаруживают у разных видов рептилий с помощью
молекулярных методов . Неклассифицированные провирусы, напоминающие
ретровирусы млекопитающих С-типа, были выделены от тигрового и пестрого питонов
.
Болезнь телец включения (IBD). Заболевание известно уже почти 30 лет; его
регистрируют у питонов и удавов в коллекциях змей по всему миру; характеризуется
образованием крупных эозинофильных включений в цитоплазме различных клеток
эпителиального типа и нейронах ЦНС .
В настоящий момент предполагается, что IBD — инфекционное заболевание,
вызывающее системное нарушение клеточного метаболизма, по-видимому,
индуцированное ретро-вирусом и имеющее характерные клинические манифестации.
По данным разных авторов, IBD встречается в основном у императорского удава В.
constrictor imperator, других подвидов В. constrictor, кольчатого удава С.
annulatus, а также у некоторых питонов, в основном у тигровых. Этому
противоречат данные Garner Raymond , которые не обнаружили заболевания ни у
павших питонов (п=301), ни у анаконд (п=20). В некоторых случаях при характерной
клинике IBD и обнаружении ретровируса в тканях характерные тельца включения не
образуются , в других случаях гистологически поставленный диагноз не был
подтвержден результатами ТЭМ. Такие сомнительные случаи IBD описаны у
уже-образных змей L.pyromelana и маисовых полозов Е. guttata [10], а также
у нескольких видов питонов рода Morelia и пальмовых ботропсов В. marchi . В
настоящее время не ясно, являются ли эти заболевания результатом заражения одним
или несколькими видами ретровирусов или представляют собой болезни разной
этиологии, имеющие сходное клиническое течение.
Характеристика возбудителя. При электронной микроскопии пораженных тканей
выявляют вирусные частицы, схожие по морфологическим характеристикам с вирионами
ретровируса рептилий С-типа. Вирус обладает обратной транскриптазной
активностью.
Вирус был впервые выделен группой Шумахера в 1994 г. и идентифицирован в
соответствии с триадой Коха. Од-нако впоследствии оригинальный изолят был
утерян. Повторно вирус был изолирован группой Якобсона , но триаду Коха
удалось выполнить лишь частично. И в этом случае, и при инокуляции здоровым
змеям других штаммов ретро-вирусов, выделенных впоследствии, не возникает
характерных изменений в клетках, хотя наличие вирусного антигена определяется
посредством ПЦР. При этом введение суспензии зараженных тканей вызывает IBD у
здоровых змей . Интересно, что согласно исследованиям ультраструктуры
включений, последние состоят только из белковых метабо-литов, т.к. клетки не
имеют дегенеративных изменений, не индуцируют воспалительную реакцию и не
содержат инфек-ционного агента. В дальнейшем удалось выяснить, что тельца
включений в основном состоят из антигенно-уникального белка массой 68 кД .
Клинические признаки и патологоанатомические изменения. У заболевших змей
отмечают медленно прогресси-рующую кахексию, нарушение линьки, координации
движений, отрыгивание корма, неврологические расстройства («вертячку»,
анизохорию, задирание и подергивание головы, опистотонус, неправильное положение
колец тела), реже возникают новообразования (в основном на коже) и лейкоз-ные
реакции (до 80...100 тыс/мкл, преимущественно лимфо-циты и пролимфоциты), а
также вторичные инфекции.
Изменения, выявляемые на вскрытии, обычно носят вторичный характер. Отмечают
подагру почек, септический тромбоз, гепатоклеточный липидоз или гепатит, меланоз
печени, дегенеративные изменения в поджелудочной железе и почках,
интерстициальную пневмонию и т.п. Патогномонич-ным симптомом для удавов и
питонов считают воспаление и формирование абсцессов в солитарных железах
пищевода, развитых у ложноногих змей .
Эозинофильные включения в цитоплазме можно наблюдать практически в любых клетках
и тканях, однако их количество может сильно варьировать. В отдельных случаях при
световой микроскопии включения вообще не выявляются. Чаще всего их можно
обнаружить в экзокринной части поджелудочной железы (в 100 % случаев), в
эпителиальной выстилке пищевода и желудка (в 30 % случаев). При лейкозных
реакциях включения выявляются в цитоплазме приблизительно в 1% периферических
лимфоцитов.
Антигенная вариабельность и родство. Исследованные ретровирусы позвоночных
характеризуются высокой видоспецифичностью, и поэтому вполне вероятно, что
различные штаммы ретровирусов, выделенные от змей, будут обладать генетическим и
антигенным полиморфизмом. Пока, тем не менее, данные о секвенировании
вирус-специфических нуклеиновых кислот и сравнительном анализе с известными
генами других изолятов ретровирусов в литературе не представлены. Вирусные белки
от 3 изолятов ретро-вируса RV-1, 2, 3, выделенных от обыкновенного и
мадагас-карского удавов , показали сходные характеристики при миграции в агарозном геле. Был исследован специфический белок массой 68 кД, формирующий
тельца включений; к нему получили моноклональные антитела, был проведен блотинг
и предприняты попытки секвенирования. Однако полученные результаты с данными
других проб белков пока не сравнивали .
Известно, что морфология телец включений при исследовании с помощью ТЭМ может
различаться. Например, вклю-чения, обнаруженные у полозов Е. guttata, были
связаны с мембранами ЭПР, содержали электронно-плотный флуктуирующий материал;
размер включений составлял 2...4 мкм. Включения, описанные у обыкновенного удава
В. constrictor, не были связаны с мембранами, содержали электронно-плотные
субъединицы, лежащие по периферии включения, и были размером 1...4 мкм .
Другие тельца включений могут содержать мелкие филаменты, электронно-плотные
субъединицы или гексагональные капсиды. Непонятно, чем обусловлены обнаруженные
различия: полиморфизмом вирусных штаммов, особенностями клеточного метаболизма у
разных видов змей или речь вообще идет о разных заболеваниях вирусной или
невирусной природы.
Экспериментальная инфекция. Триада Коха для IBD была выполнена группой
Schumacher и затем Jacobson . При инокуляции суспензии зараженных
тканей экспериментальным животным включения в гепатоцитах формировались через
15...24 нед.
Эпизоотологические особенности. В конце 70-х, начале 80-х годов в США IBD
регистрировали преимущественно у молодых, разведенных в неволе тигровых питонов.
У этих змей болезнь протекает более остро и неврологические нарушения наблюдают
чаще, чем у других видов . Это может указывать на отсутствие у данного вида иммунокомпетентнос-ти к IBD или о низком уровне сероконверсии. В последние 10
лет болезнь чаще всего встречается у обыкновенных и императорских удавов .
Недавнее исследование на наличие вирусного антигена с помощью nested PCR у диких
удавов в Коста-Рике и содержавшихся в коллекциях Германии (п=22), выявило
позитивную реакцию практически во всех образцах крови, взятой от удавов, и ее
отсутствие в образцах от других видов змей . Это заставляет предположить,
что болезнь имеет природный резервуар в популяции обыкновенных удавов в Южной
Америке. Источником служат в основном персистентные носители и клинически
больные животные. Распространяется инфекция, вероятно, посредством пассивной
трансмиссии змеиным клещом О. natricis, контактно, с кормом и водой, а также,
возможно, путем вертикальной передачи эндогенных форм вируса от родителей.
Вирусоносительство и выделение вируса. Несомненно, что вирус может начать
выделяться задолго до появления клинических симптомов у змей, являющихся
источником инфекции. Медленное прогрессирование заболевания, стертые клинические
симптомы делают возможным заражение и от манифестных больных. Без внедрения в
практику сероло-гических и других методов прижизненной диагностики заболевания
достоверно оценить эпизоотическую ситуацию по IBD пока невозможно.
Диагностика. Диагноз ставят на основании клинических симптомов и обнаружения
телец включения в тканях больных животных. Для прижизненной диагностики
рекомендуют слепую пункционную биопсию печени или эксци-зионную биопсию
слизистой из области пищеводных желез и кардии желудка, выполненную с помощью
фиброэндоско-па. Можно брать биоптат кожи (на всю толщу кожного лоскута) из
нескольких участков. Включения можно изредка обнаружить в миелоцитах и
лимфоцитах костного мозга или мазках периферической крови. Однако в
цитологических образцах включения плохо прокрашиваются при использовании
модификаций Романовского, а клеточный материал быстро разрушается вследствие
осмотического шока. Образцы тканей, в которых включения были выявлены с помощью
световой микроскопии, нужно исследовать с помощью ТЭМ, чтобы уточнить природу
включений. Кроме того, желательно исследовать гистологический материал
посредством специальных окрашиваний на наличие нуклеиновых кислот. Рекомендован
также электрофорез для выявления специфического 68-кД белка, но для этого
пригоден только свежий или замороженный материал, не обработанный фиксаторами.
В последние годы были получены антивидовые сыворотки к IgG Boa constrictor, на
основании которых разработали и тестировали непрямую ELISA для обнаружения
антител к ретровирусу. В качестве вирус-специфического антигена использовали
очищенный штамм, выделенный от Boa constrictor с IBD в культуре клеток VH-1 в
2001 г. .
Кроме того, получили моноклональные антитела к 68кД-белку . Однако ELISA
пока не введена в практику. В Германии используют недавно разработанную
nested-PCR на праймерах к вирус-специфической протеазе и обратной транскриптазе.
Эндогенные провирусы у рептилий обнаруживают с помощью ПЦР на субстрате культуры
лейкоцитов . Тем не менее, посмертное гистологическое исследование пока
остается единственным практическим методом диагностики IBD, принятым во всех
странах.
Дифференциальная диагностика. Клинически IBD необходимо дифференцировать от
любых инфекционных и не-инфекционных заболеваний, вызывающих неврологические
нарушения, такие, как менингоэнцефалит, полигиповитами-нозы В, подагра,
интоксикации, инсульт и т.п. При обнаружении включений в цитоплазме или ядрах
клеток эпителиально-го типа или нейронах необходимо определить природу этих
включений. Обнаружение эозинофильных цитоплазматичес-ких включений с помощью
световой микроскопии не уточняет диагноз IBD. Специальные гистохимические
окраски способны помочь в определении нуклеинового материала телец включений,
который может свидетельствовать о присутствии вирионов. Окраску метиловым
зеленым пиронином используют для выявления РНК. Реакция Фельгена используется
для окраски ДНК, где акридиновый оранжевый окрашивает РНК в красно-желтый, а ДНК
в желто-зеленый цвет.
У млекопитающих практически нет заболеваний невирусной природы, при которых
образуются внутриклеточные включения . Исключением можно считать образование
телец Маллори, которые состоят из гиалина. Отравление свинцом может быть
причиной появления внутриядерных включений, представляющих собой
свинцово-гистонные комплексы . При вирусном заболевании у рептилий могут
появляться включения, содержащие вирусные компоненты, такие, как капсид,
нуклеиновый материал, однако включения без вирусного компонента тоже иногда
присутствовуют при вирусных инфекциях, и не только в случае IBD. Это было
продемонстрировано при парамиксовирусной инфекции, когда в цитоплазме эпителия
протоков поджелудочной железы гремучников образовывались характерные
эозинофиль-ные включения, которые состояли исключительно из гомогенного
белкового материала . Таким образом, если при-сутствуют включения, следует
брать пробы для исследования (специальное окрашивание на нуклеиновый материал,
электрофорез для определения вирусного белка и сопоставление ультрамикроснимков,
полученных с помощью ТЭМ, со структурной морфологией включений).
Терапия. Не разработана. Змей с подтвержденным диагнозом IBD следует подвергать
эвтаназии. Единственное со-общение о попытке применения ингибиторов обратной
транскриптазы для рептилий сделал Levine . Автор ис-пользовал для терапии
обыкновенного удава с лейкемичес-кой формой IBD препарат Trizivir (Glaxo,
SmithKline), пред-ставляющий собой комбинацию трех ингибиторов ревертазы
(abacivir, zidovudine и lamivuridine). Доза была рассчитана аллометрически от
млекопитающих и составила по компоненту абацивир 5 мг на змею массой 32 кг
каждые 72 ч. На фоне терапии нормализовалась картина крови, и змея начала брать
корм. К сожалению, удав вскоре пал, и т.к. вскрытие не проводили, автор не смог
сделать окончательного заключения об эффективности назначенной терапии.
Реовирусы
Большая группа вирусов, поражающих позвоночных, насекомых и растения. Вирионы
представляют собой некон-вертирующиеся икосаэдрические частицы размером 60...80
нм, состоят из двойного капсида и сердцевины, содер жащей 2-спиральную линейную
РНК. Семейство Reoviridae включает 9 родов.
Характеристика возбудителя. Впервые о вирусном энцефалите удавов, возможно
ошибочно, сообщил Axthelm . Наиболее специфическое заболевание, связанное с
поражением нижних отделов респираторного тракта, описано у полозов Е. mollendorfi и Е. taeniura . При эпизоотической вспышке в группе аризонских
королевских змей L. pyromelana отмечали поражение тонкого кишечника и печени
. Вирус также был выделен от взрослой самки удава В. constrictor, с
характерной клиникой IBD . Эпизоотическую вспышку респираторного заболевания
регистрировали в группе мохавских гремучих змей С. scutulatus . Кроме того, ретровирусы были изолированы от клинически здоровых рептилий, собакоголовых
удавов С. caninus; королевских питонов P. regius; полозов Е. longissima,
зеленого гремучника С. viridis, игуан /. iguana и Ctenozaura sp., зеленой
ящерицы L. viridis.
Клинические признаки и патологоанатомические изменения. У рептилий реовирусы
вызывают острую летальную пневмонию, подострый трахеит, симптомы поражения ЦНС,
поражение ЖКТ и печени, в редких случаях их изолируют от удавов наряду с
ретровирусами при IBD. Прижизненно может отмечаться снижение массы тела,
отрыгивание корма, респираторный синдром.
На секции выявляли острую интерстициальную бронхопневмонию, некротизирующий
колит или гепатит с образованием многоядерных формаций, серозную атрофию жира.
Тельца включений обычно вьывляются только с помощью ТЭМ в цитоплазме
энтероцитов, гепатоцитов и альвеоцитов.
Антигенная вариабельность и родство. Во всех случаях, когда секвенировали
вирусную РНК, вирус был отнесен к роду Orthoreouirus. Вирус охарактеризован как
новый, отличающийся генетически от ортореовирусов птиц и млекопитающих.
Экспериментальная инфекция. Lamirande et al заразили тонкохвостых полозов
Е. taeniura изолятом, выделенным от спонтанно инфицированных полозов Меллендорфа
Е. mollendorfi, и частично выполнили триаду Коха. Группа Райчел Маршанг инокулировала суспензию культуры вируса, выделенного от самки обыкновенного
удава В. constrictor с клиникой IBD, 10 новорожденным удавам. Вирусную РНК
обнаружили у всех инфицированных змей через 18 нед с помощью ПЦР и выдели вирус
в культуре у части животных после эвтаназии.
Диагностика. Включает в себя выделение вируса в культуре клеток сердца гадюки
(VH-2), обнаружение вирусных частиц в тканях рептилий с помощью ТЭМ,
ПЦР-диагности-ку (nested PCR) на праймерах к вирусной РНК-зависимой полимеразе
ортореовируса млекопитающих и аквареовируса рыб . Единственный разработанный
серологический тест - РН .
Дифференциальная диагностика. При поражении легких надо исключить
парамиксовироз, ЖКТ — аденовироз, при поражении ЦНС — ретровироз (IBD).
Терапия. При эпизоотических вспышках в группах королевских змей и мохавских
гремучников часть животных удалось сохранить, назначив поддерживающую терапию и
профилактику вторичной инфекции цефтазидимом.
Д.Б. Васильев, B.C. Швед
Московский зоопарк.
Ветеринарная клиника «Белый клык» (Москва)
vetclub.ru/content/view/68/72/
|
